A. 什麼防曬能塗臉
什麼防曬能塗臉
什麼防曬能塗臉，夏天的時候人們為了防曬而塗抹防曬霜，而且防曬霜呢很好的防護我們的肌膚，但很多的人對於防曬霜的用法和注意事項不太清楚，以下是關於什麼防曬能塗臉。
防曬霜塗於面部，不包括眼圈，應該避開眼睛的部分，因為我們的眼部皮膚是整張臉最嬌嫩和脆弱的地方，要用專用的眼部護理產品。
其他部位暴露在外的皮膚也要防曬。
不管用的是什麼牌子的防曬霜，之前都要塗抹爽膚水和乳液，爽膚水是補水的，而乳液是鎖水的，如果不塗抹這些而直接塗抹防曬霜的話，皮膚會覺得很乾燥，這樣對皮膚也不好。
如果用防曬霜，一定要用卸妝油，這樣可以讓你的皮膚更干凈清爽，防止因為灰塵的堆積而產生色斑。
4、如何選擇防曬霜
（1）油性皮膚：油性膚質的人皮脂腺分泌油脂旺盛，毛孔粗大，需要選擇滲透性較強的水劑型、無油配方的防曬霜，選擇塗抹起來使皮膚清爽不油膩，利於皮膚快速吸收的防曬霜。
（2）乾性皮膚：乾性皮膚最大的問題就是皮膚缺水，皮脂腺活動減弱，角質層水分含量低下，所以乾性膚質的人選擇防曬霜的關鍵是能給皮膚提供水分和營養。乾性皮膚的人需要選擇質地滋潤，除了防曬還帶有補水功效的防曬霜。
（3）敏感皮膚：敏感膚質的人皮膚天生防禦能力低，皮膚角質層較薄，更易被曬傷。所以敏感膚質的'人選擇防曬霜時一定要格外注意，選擇專門針對敏感性膚質的人的防曬霜或者選擇一些產品上有註明「不含防腐劑」、「通過過敏性測試」。
1、防曬霜能直接塗臉上嗎
不可以。防曬霜對肌膚是有傷害的，防曬指數越高，傷害就越大。因此，塗防曬霜前要先做好基礎的打底，形成隔離。否則很容易堵塞毛孔，阻礙皮膚的正常代謝，引發色斑、粉刺等皮膚問題。
2、塗防曬霜之前要塗什麼
第一步：爽膚水
爽膚水的作用是再次清潔，以恢復肌膚表面的酸鹼值，並調理角質層，使肌膚更好地吸收，並為使用保養品作準備。
第二步：保濕乳液
乳液含水量很高，可以瞬間滋潤肌膚，其中所含的油脂，又可以隔離外界乾燥的氣候，防止肌膚水分過快流失，避免肌膚乾裂，起皮。
第三步：面霜
塗完乳液後，要再上一點輕質的面霜加強鎖水保濕的作用，同時又能形成隔離，防止防曬霜的成分堵住毛孔。
第四步：隔離霜
如果是需要化妝或者長時間面對電腦，可以選擇合適的隔離霜，讓皮膚與外界的輻射、臟空氣、化妝品形成隔離。
第五步：防曬霜
做好前面四個步驟後，最後就是塗防曬霜。所用的防曬霜看SPF值、PA值，最好與要活動的場合相符，如果是海邊、軍訓等，紫外線強度較高的場合，選擇SPF30以上防曬才會有效，如果是日常上班，SPF15足夠了。
3、塗防曬霜後要注意什麼
室外2-3小時補一次
防曬霜並不是塗了就能一直有效果的，特別是在室外，每隔2-3小時要補塗一次，室內的話，可以半天補一次。
徹底卸妝
防曬霜屬於化妝品，含有很多化學成分，塗在臉上不卸妝的話，會堵塞毛孔，影響皮膚的呼吸作用，最終會導致毛孔堵塞、長色斑、粉刺等一系列皮膚問題。
大寶防曬霜可以塗臉嗎
一般來說大寶防曬是可以塗在臉上的，不過也要注意如果出現過敏情況就不要再使用了，並且防曬霜一般在出門半小時前使用效果最好，但是大寶防曬霜的防曬系數比較低。
大寶清爽保濕防曬露，蘊含水 礦油 甘油 鯨蠟硬脂醇 聚二甲基硅氧烷(硅油) 月桂醇磷酸酯鉀 超氧歧化酶(SOD) 人參根提取物 膜莢黃芪根提取物 甘油硬脂酸酯 EDTA二鈉 香精 羥苯甲酯 羥苯丙酯 DMDM乙內醯脲。
大寶清爽保濕防曬露75gSPF 20/PA++，有效防曬。同時抵禦紫外線UVA和UVB， 減少肌膚曬傷、曬黑。清爽透氣不油膩，質地輕薄,清爽透氣無負擔, 為肌膚提供舒適的夏日防護。
產品質地溫和，適合與家人分享。因為大寶清爽保濕防曬露不能防水防油的特性，清爽保濕防曬露並不需要使用專業的卸妝產品卸除，只需要用普通的深層潔面型的洗面奶，就可以輕松卸除了。
大寶防曬霜好嗎
好像大寶最近新出的產品在外包裝方面走小清新路線，反面有詳細的說明，它是75g的，也可以用很久啦。紙盒的頭部有封貼，可以保證是否有人用過或拆開過，讓人很放心。打開紙盒後，可以發現它是簡潔的白色外包裝，整體感覺還不錯。
兩個++足夠日常的防護了。有標明限期使用日期，螺旋式的蓋子，瓶口很小，可以很好地控制使用的量，不怕浪費。使用效果展示：擠出來是白色的乳液般的質地，淡淡的清香，很好聞。延展性很好，一抹就開了，十分輕薄，很快就吸收了。
塗抹了防曬露的那一部分比較光滑，細致。而沒有塗抹的那一部分比較粗糙，手部的紋路也比較明顯。大寶防曬霜濕度報告，這是使用前的，肌膚處於比較乾燥缺水的狀態，只有26%左右。
大寶防曬霜價格介紹
價格：39.9元
產品名稱：大寶 清爽保濕防曬露SPF20/PA++
化妝品保質期: 36個月
防曬指數: SPF20
PA值: PA++
適用對象: 通用
規格類型: 正常規格
化妝品凈含量: 150g
適用部位: 全身防曬
分類: 防曬乳/霜
品牌: 大寶
面部防曬單品: 清爽保濕防曬露SPF20/PA++
適合膚質: 任何膚質
是否為特殊用途化妝品: 是
功效: 防曬
大寶防曬霜孕婦能用嗎
不建議孕婦使用。
建議孕婦選擇一些專門針對孕期女性所開發的性質溫和的產品，盡量不使用美白類產品，盡量以保濕的防護類為主，不要適用多功能護膚產品。大寶防曬霜具有保濕防曬雙重功效，輕薄透氣不粘膩 主要成分： SPF20/PA++——有效防護UVAUVB SPF20減少肌膚曬紅、曬傷。 PA++減少肌膚曬黑、防止肌膚老化。
海藻精華——「全方位」保濕能手 增加肌膚的保水性，防曬同時水潤肌膚。 多種海洋礦物——來自大海的清爽魔力 質地輕薄，不黏膩，肌膚無負擔。使用後的肌膚非常清爽，不會很黏膩;大寶清爽保濕防曬露的質地比水稍微濃稠，塗在肌膚上延展性好，觸感光滑水潤;對比使用這款防曬露前後區別，發現膚色由暗黃變得白皙嫩滑，說明大寶清爽保濕防曬露可以修正膚色。
B. 生信分析軟體總結合集
持續更新中
EDTA ：TE 注釋工具。是一個可以從頭注釋全基因組中的TE並且評估已有TE庫注釋優劣的工具包。該工具的主要步驟是過濾掉原始TE中注釋錯誤的，從而注釋出全基因組中較高質量的非冗餘TE庫。
OrthoFinder ：做進化、基因家族分析、比較基因組使用。它查找直系群和直系同源物，推斷所有直系群的根源基因樹，並識別這些基因樹中的所有基因重復事件。 它還為要分析的物種推斷出一個有根的物種樹，並將基因復制事件從基因樹映射到物種樹中的分支。
TRF ：是基因組注釋中常用於檢測序列中串聯重復序列的軟體。
cafe ：基因家族收縮和擴張。
GMATA ：分析基因組中的SSR序列（SSR：微衛星序列，串聯重復）
RepeatMasker ：鑒別轉座子（TE）屏蔽轉座子（TE）。
PASA ：是一種真核生物基因組注釋工具，利用轉錄組數據的可變剪接比對自動構建的基因結構模型，從而保持基因結構注釋與轉錄組實驗數據一致。（基於轉錄組測序）
GeMoMa ：是基於同源性進行基因預測的軟體。通過近緣物種蛋白編碼基因對本物種的序列進行基因結構的預測，主要是根據氨基酸和內含子的保守性。此外，也可以整合轉錄組比對數據進行可變剪接位點的分析。
AUGUSTUS ：是真核基因組結構從頭預測軟體，主要運用廣義隱馬爾可夫的概率模型(GHMM)進行基因結構的預測。通過分析DNA序列在概率模型中最有可能的基因結構，從而發現目標DNA序列中的基因。此外軟體自身包含常見模式生物訓練集，可利用這些物種直接進行基因預測；也可以利用同源預測和轉錄組最優結果生成訓練集，預測基因。
EVM ：對收集到的這些數據進行整合，獲得非冗餘外顯子集合，從而定義出更加可靠的基因結構。（整合基因結構）
fastp ：最新的質控軟體。
Hisat2 ：質控之後的比對軟體。
Stringtie ：將比對信息轉為轉錄本坐標文件。
MUSCLE ：蛋白質水平多序列比對軟體，和ClustalW、T-coffee相比速度最快。
hasit2、STRA ：基因組比對軟體，STRA更准確，但計算速度慢，所需內存大。
bowtie2 ：轉錄組比對軟體。
C. 電腦恢復出廠設置就沒有開機密碼了吧
沒有了，都需要等完全恢復到初始之後重新設置。所以有什麼文件也建議備份好，避免因為恢復而使數據遺失。
D. 2022-05-27軟體安裝：EDTA的安裝與配置
參考
https://www.jianshu.com/p/10e3e9715a77 （使用conda一鍵安裝；這里可能需要更新一下RepeatMasker自身帶的庫文件，詳細見先前）
https://www.jianshu.com/p/ddd1c9a74fde （詳細介紹了四種安裝方法和使用方法）
E. 2020-08-24質粒構建
獲取一個基因CDS序列的方法如下：
打開NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下圖，按照順序，在1處選擇Nucleotide，在2處輸入「PDCD1」，點擊3處的Search，等出來結果之後點擊4處的「Homo Sapiens」進行進一步篩選（如果你要做鼠源的就選Mus musculus，其他種屬選擇相應的名稱即可進一步篩選了）
然後第一條就是我們需要的序列信息，點擊進去，往下拉，直到看到CDS（如下圖）
點擊CDS，就出現了下圖中所示內容，其中加了底色的部分序列便是我們需要的序列了，可以看到這段序列開頭是ATG起始密碼子，最後三位是TGA終止密碼子。選中這段序列復制即可。
由於需要PCR整個CDS區域，所以正反向引物並沒有多少選擇的餘地，甚至可以參照上述原則簡單粗暴的從正反向各選擇22個鹼基左右作為引物，例如：!
正向引物序列與CDS相同，反向引物序列與CDS互補。另外要注意的是寫引物等序列都是要5』到3』的方向，一般不會從3』到5』，所以我們的CDS雖然沒有註明方向，但是其實也是5』到3』。
雖然可以這么簡單粗暴的設計引物，但是還是想藉此教大家使用一下引物設計的經典軟體Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下圖，首先點擊File->New->DNA Sequence，
然後點擊空白處Ctrl+V粘貼我們的CDS序列，選擇As is，即我們復制的是什麼樣的序列就粘貼的什麼樣的序列。
下面的依次是「反向序列粘貼」、「互補序列粘貼」「反向互補序列粘貼」。
點擊左上角的Primer，如下圖，S=Sense，A=Antisense
如果對現在的引物不滿意，還可以點擊Edit Primers編輯序列，如下圖，我們刪除掉末尾三個鹼基，之後需要先點擊Analyse，然後才能點擊OK，我們可以看到正向引物已經從25個鹼基變為22個鹼基了。
最後點擊Edit->Copy->Sense Primer，粘貼到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之後粘貼也會自動變為5』到3』的序列。所以非常方便。
這樣我們PDCD1用於PCR的正反向引物就初步設計好了。如果你只是想P出PDCD1這個基因，現在的引物就可以送去合成了，但是如果你想將其構建到載體上，那麼我們還要對其進行進一步的加工。
Primer 5的使用
根據不同的目的，可以選擇不同的載體，如過表達（pcDNA 3.0）、敲減（pLKO.1-TRC）、原核純化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包裝（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我們就以過表達載體pcDNA 3.0為例進行講解。
從質粒圖譜上可以看到多克隆位點有多個酶切位點可以選擇，那是不是每個位點都可以用呢？當然不是！我們要 選擇那些PDCD1（或其他目的基因）本身沒有的酶切位點！
所以我們還需要用Primer 5來分析一下哪些是PDCD1所沒有的。
還是打開Primer 5，然後粘貼CDS序列，點擊Enzyme，2為所有的酶，我們比對質粒圖譜選擇多克隆位點的酶，雙擊即可到3的框中，選好之後點擊OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI兩個酶切位點，所以這兩個不可以選，其他的都可以選。
不過一般選擇常用好用的最好是實驗室就有現成的那些酶了。比如我們選擇EcoRI和XhoI，那麼我們就可以在對引物加上相應的酶切位點了。
於是我們得到如下引物：
好了，我們現在就可以將這些引物送去相應公司合成了。
質粒構建
終於到正題了！
待引物合成之後，我們用ddH2O將其稀釋到 100 μM 作為母液，取一些稀釋到 10 μM 做下一步實驗了。
首先我們P出目的基因，這一步建議用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反應體系及反應條件如下圖：
模板的獲取
PCR完成之後跑1%的膠回收目的片段，也可以直接用PCR Clean試劑盒回收。回收之後將其雙酶切，同時需要酶切適量載體。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，還可以打開網址 http://t.cn/RVuwBVo 查詢雙酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之後的片段進行連接，我使用的是 Thermo公司的T4連接酶 ，體系如下：
現在的T4連接酶基本都是快酶，比如Thermo的這款聲稱10 min就可以連接完成，不過我保險起見，一般連接30 min， 切勿連接過夜！
連接完成之後便是轉化，挑菌（單克隆），搖菌抽提質粒，送去測序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比較成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比較穩定且廣泛應用的，當然現在一些國產的TRIzol類產品也能滿足大部分情況下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事項及原理
注意事項：
1、RNA酶（RNase）非常穩定，是導致RNA降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除後又會迅速復性。用常規的高溫高壓蒸汽滅菌法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在於人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關的分子生物學實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情況下採用用DEPC配製的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部。提取RNA時使用專門的RNase-free的槍頭和離心管。
2、TRIzol試劑具有較強毒性，如沾到皮膚立刻用大量的清潔劑和水沖洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol試劑：TRIzol能在破碎細胞、溶解細胞內含物的同時保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。異硫氰酸胍，是一種強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。
2、氯仿：氯仿可增強TRIzol中的8-羥基喹啉對RNase的抑製作用。另外氯仿作為有機溶劑，加入氯仿後離心可使溶液分層，上層為水相，下層為有機相。苯酚為弱酸性，酸性條件下（一般為Ph5.0）DNA和蛋白質進入有機相，而RNA留在水相；反之亦然，弱鹼性（Ph8.0）時DNA留在水相。
3、異丙醇、無水乙醇、70%乙醇：異丙醇和乙醇能與水任意比例互溶，因此加入異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分，使其脫水沉澱。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化學修飾劑，它與RNase的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制其活性。DEPC有毒性，操作時應小心。誰說是最優秀的；誰是最自由的，誰也就是最優秀的，在他們身上，才會有最大的美。
操作步驟
1、細胞破碎
A、組織：按1 mL/50~100 mg組織樣品的比例向打散的組織塊中加入TRIzol試劑，樣品的體積不能超過TRIzol體積的10%。
B、貼壁細胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol試劑，並用移液槍反復吹吸數次。TRIzol試劑過少會導致DNA污染。
C、懸浮細胞：懸浮細胞離心收集後，直接按1 mL/5~10×106個細胞（動物、植物或酵母）的比例加入TRIzol試劑。加入TRIzol前不要洗細胞，否則易造成mRNA的降解。
如果樣品中含有較多的蛋白、脂肪、多糖或其他細胞外物質，如肌肉、脂肪組織或植物的塊根等，可在2℃~8℃，12000×g離心10 min去除這些物質。
關於TRIzol的用量，Invitrogen官方說明書中有建議用量：
一般情況下，根據細胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（僅供參考）
2、氯仿抽提分層
加入TRIzol後，室溫（15℃~30℃）孵育5 min保證核蛋白復合體充分解離。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。蓋緊管蓋後劇烈搖晃15s，室溫靜置2 3分鍾。12000×g，2℃ 8℃離心10 min，轉速不可過高否則會導致RNA斷裂。離心後液體分為三層，下層為紅色的有機相（酚-氯仿），中間為白色的沉澱，上層為無色的水相。RNA在上層水相中，水相的體積約為加入的TRIzol體積的60%。
3、用異丙醇使RNA沉澱
將上層水相轉移到一個干凈的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白質就保存下層有機相。
加入與水相等體積的異丙醇，室溫孵育10 min。12000×g，2℃~8℃離心10 min。RNA沉澱一般附著在遠離離心機軸心的管底，為無色膠狀。
4、用乙醇洗滌去除殘留的蛋白質和無機鹽
去除上清後，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配製）洗滌RNA沉澱。震盪混勻RNA後，7500×g 2℃~8℃離心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清後，將管子敞口晾5~10 min，使RNA沉澱呈現半透明狀。不要讓RNA沉澱變成完全不透明，那時RNA完全乾燥將會大大影響RNA的溶解。根據後續實驗要求加入適量的DEPC水，用移液槍反復吹吸數次後。
逆轉錄法合成cDNA
一般逆轉錄（也可稱作反轉錄）都有現成的試劑盒，只要大家按照試劑盒的說明書來操作，問題都不大，在這里我就以TAKARA的逆轉錄試劑盒為例稍加說明。
Random 6 mers 為隨機的6核苷酸引物，引物序列為5'-(P)NNNNNN-3'，特點是產物量大，特異性差，適用於長的或具有Hairpin構造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內的所有RNA的反轉錄反應都可使用本引物。
Oligo dT Primer 適用於具有Poly（A）Tail的RNA，因而特異性好，但因其只結合Poly A尾巴，對於較長的mRNA，經常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
兩種引物可據實際情況使用一種，也可同時使用。還有一種情況，當只擴增一種目的基因時，也可以使用Specific Primer（PCR時的下游引物）作為反轉錄引物。
操作步驟
步驟簡述如下：按照下圖中1配製溶液，然後65℃處理後加入3中所配製溶液繼續後續反應即可。
連接產物的轉化
常用的感受態細胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提質粒一般用DH5α，可以自己制備也可以購買商業化的感受態。
ABOUT Transformation
注意事項
1. 感受態細胞要現用現融，剛剛融化的感受態轉化效率最高；
2. 避免反復凍融感受態細胞；
3. 整個操作過程要輕柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受態和連接產物（或質粒）用量要適中，並不是越多越好。
操作步驟
1. 取50 μL感受態細胞置於冰上融化；
2. 加入5 μL連接產物（質粒一般只需用白色槍頭沾取一下即可），混勻，置於冰上靜置30 min（此時應該打開水浴鍋並調溫至42℃）；
3. 42℃水浴中熱激90 s，迅速置於冰上靜置2 min；
4. 加入500 μL無菌的LB培養基（不含抗生素），混勻後置於37℃，200rpm的恆溫搖床中培養1 h，使細胞復甦；
5. 連接產物：3000 rpm離心5 min，棄上清，留取少量LB（50 μL左右），重懸沉澱，全部均勻塗布於LB培養板（需含相應抗生素）上，37℃ 倒置培養 16 18h；質粒：直接取20 50 μL塗於LB培養板上培養即可。
質粒的小量提取
ABOUT 質粒抽提
實驗原理：
較常用的質粒提取方法有三種：鹼裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用於較小的質粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用於分離大質粒（>15kb）。
鹼裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒的方法，其原理為：當細菌暴露於高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。
由於質粒DNA分子比染色體DNA大得多，且前者為共價閉合環狀分子，後者為線狀分子。只要鹼處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，質粒DNA雙鏈就會再次形成。
在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會互相纏繞成大型復合物，後者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋。
當用鉀離子取代鈉離子時，這些復合物會從溶液中有效地沉澱下來。離心除去沉澱之後，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
本方法採用Tiangen小提中量試劑盒進行提取，其純化系統是硅基質吸附材料，其原理為在高鹽環境下質粒DNA能夠結合到硅基質上，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最後用低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質粒可以用於酶切、PCR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
實驗試劑（試劑盒試劑配方不清楚，以下配方見《分子克隆實驗指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用於提供一個合適的緩沖體系；50 mM葡萄糖可以使懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；而EDTA 作為Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，起到了抑制DNase的作用；RNase作用為去除質粒中混有的RNA，其不受EDTA的影響。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在於使細菌裂解，而SDS作用在於加入P3之後是被其包蓋的細菌蛋白，染色體DNA一起作為沉澱析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸
原理：這一步的K+置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉澱；SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質也沉澱了，同時染色體DNA也被PDS共沉澱。而醋酸用於中和鹼，使溶液恢復中性，從而使質粒DNA復性。
操作步驟
1、將過夜培養的菌液（5-15ml）從搖床中取出，並擰緊蓋子，9000 rpm離心10 min，用泵盡量吸除上清。若暫時不提取，可將沉澱保存於-20℃，也可直接將菌液保存於4℃（短時間）。
注意：如果菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中。
2、柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請使用當天處理過的柱子）。
注意：若柱子放置較久，需要進行這一步驟；否則，可省。
3、向留有菌體沉澱的離心管中加入500μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA，並置於冰上 ) ，使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱，並移至2ml離心管中。如果沉澱的菌體較多，則相應增加P1的用量（之後P2和P3的用量也應成比例增加），並分到幾個管子中分別進行步驟4和5的操作（不然P1+P2+P3的總體積超過2ml離心管容積），步驟6過上清時可過同一個吸附柱。
注意：菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質粒的提取效率。另外，務必徹底懸浮細菌沉澱，如果有未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導致提取量和純度偏低。
4、向離心管中加入500μl溶液P2 ，溫和地上下翻轉6-8 次使菌體充分裂解。由於P2裂解不應超過5 min，以免質粒受到破壞。故加入P2前將計時器定時4 min，以免超過時間。但是時間也不可過短，以免裂解不徹底。每管操作時間盡量一致。
注意：溫和地混合不要劇烈震盪，以免污染基因組DNA 。此時菌液應變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由於菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。
5、向離心管中加入700μl溶液P3（記得冰上預冷），立即溫和地上下翻轉6-8 次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉澱。放置冰上10min，之後12000rpm ( -13400g ）離心10 min，此時在離心管底部形成沉澱。如果上清量較大，需要多次過柱，可將上清轉移至新的離心管中，以免沉澱飄起。
注意：P3 加入後應立即混合，避免產生局部沉澱。如果上清中還有微小白色沉澱，可再次離心後取上清。
6、將上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800μl）,注意盡量不要吸出沉澱。 12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質粒DNA，推薦採用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW後，如果室溫靜置2-5 min，有助於更好地去除雜質。
9、重復操作步驟8。
10、將吸附柱重新放回收集管中置於12000rpm（-13400g ）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響後續的酶反應（酶切、PCR 等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置於室溫放置數min，以徹底晾乾吸附材料中殘余的漂洗液。
11、將吸附柱置於一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫緩沖液EB（65℃預熱），室溫放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）離心2min將質粒溶液收集到離心管中。
注意：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中．重復步驟
11、洗脫液的pH 值對於洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內（可以用NaOH 將水的pH 值調到此范圍）, pH 值低於7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應少於100μl，體積過小影響回收效率，但也不應過大，以免所提質粒濃度過低，影響後面的使用。且DNA產物應保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
結果判斷
1、使用紫外分光光度計對質粒濃度及純度進行測定
（1）檢測波長為260nm和280nm，濃度看OD260，OD260值為1相當於大約50μg/ml；純度看OD260/OD280，OD260/OD280比值應為1.7-1.9，偏低可能是蛋白質污染，偏高則可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，但並不表示純度低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值。另外，測出來的OD260和OD280都應該在0.1-2.0之間，不然所得出的濃度和純度不準確。
（2）應該注意的是作為空白對照的blank管稀釋方法應該和所測樣品管一樣（如樣品為2μl所提質粒+48μl ddH2O，則blank為2μl洗脫液+48μl ddH2O）。
2、酶切鑒定，並用瓊脂糖凝膠電泳檢測
（1）選用合適的內切酶對所提質粒進行酶切，並與未切質粒及轉化用原質粒一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據酶切結果及所提質粒與原質粒位置是否一致，可以判定所提質粒是否為目的質粒。
（2）所提質粒（未酶切）的電泳條帶可能為一條帶，也可能為二到三條帶，這是因為質粒提取過程中操作過於劇烈可能使環狀超螺旋結構的質粒DNA單鏈出現缺口（保持環狀，失去超螺旋），或雙鏈斷裂（變成線狀），三種構型的質粒分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率是不一樣的，因此會出現多條帶，這也說明所得質粒不夠理想。
測序結果的分析
構建好質粒之後我們一般先酶切鑒定，鑒定正確的可以直接拿去轉染然後做WB檢測表達即可。
可以正常表達的質粒我們需要送到測序公司測序，也可以直接送菌液測序，有些測序公司還提供質粒返還服務（即送菌液返還他們抽提的質粒）。
測序的引物一般使用通用引物，如果沒有通用引物需要自行設計。常用的通用引物如下：
在公眾號內回復「 通用測序引物 」獲取此Excel！
測序結果返回之後我們就可以分析測序結果了。
一般常用的序列比對軟體有DNAMAN和Chromas，當然，還有很多類似軟體，大家可以根據個人習慣選擇，在這里就不一一介紹了。
DNAMAN
1. 首先打開軟體，左側數字為各個通道的編號，每個通道只能載入一個序列：
2. 然後點擊File->New，將我們目的基因的CDS序列粘貼進去，Ctrl+A全選，右鍵選擇Load Selected Sequence，將序列載入通道1。
3. 選擇通道2（點擊數字2即可），點擊File->Open打開測序回來的序列信息（後綴為.seq），同樣全選右鍵載入通道2，之後點擊Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在彈出窗口中，點擊Channel，選中需要比對序列的通道，點擊OK即可：
5. 後面基本是一直點擊下一步，在如下圖窗口中選中Try both strands：
6. 然後一直下一步，出來如下結果，即可比對測序結果和原CDS序列，如果有突變我們需要看一下是否是同義突變，如果是即質粒序列正確。
Chromas
1. 用Chromas軟體打開測序返還的序列信息，然後點擊File->Blast Search:
F. ISO-TBE是什麼意思
ISO是一種光碟鏡像文件，無法直接使用，需要利用一些工具進行解壓後才能使用；TBE是一個網友自發組成的黑客組織，是他們破解了matlab。可把「-TBE刪掉」，留下ISO就可以用虛擬光碟機打開或者直接解壓了。
TBE（Tris硼酸），是一種PCR技術中用到的緩沖液。54gTris鹼 27.5g硼酸 20ml/L EDTA 採用無菌水溶解混勻，NaOH調pH至8.0，溶液體積1L。TBE配方：使用液（0.5×）；0.025mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA 採用無菌水溶解混勻，溶液體積為1L；濃貯存液（5×）。