A. 什么防晒能涂脸
什么防晒能涂脸
什么防晒能涂脸，夏天的时候人们为了防晒而涂抹防晒霜，而且防晒霜呢很好的防护我们的肌肤，但很多的人对于防晒霜的用法和注意事项不太清楚，以下是关于什么防晒能涂脸。
防晒霜涂于面部，不包括眼圈，应该避开眼睛的部分，因为我们的眼部皮肤是整张脸最娇嫩和脆弱的地方，要用专用的眼部护理产品。
其他部位暴露在外的皮肤也要防晒。
不管用的是什么牌子的防晒霜，之前都要涂抹爽肤水和乳液，爽肤水是补水的，而乳液是锁水的，如果不涂抹这些而直接涂抹防晒霜的话，皮肤会觉得很干燥，这样对皮肤也不好。
如果用防晒霜，一定要用卸妆油，这样可以让你的皮肤更干净清爽，防止因为灰尘的堆积而产生色斑。
4、如何选择防晒霜
（1）油性皮肤：油性肤质的人皮脂腺分泌油脂旺盛，毛孔粗大，需要选择渗透性较强的水剂型、无油配方的防晒霜，选择涂抹起来使皮肤清爽不油腻，利于皮肤快速吸收的防晒霜。
（2）干性皮肤：干性皮肤最大的问题就是皮肤缺水，皮脂腺活动减弱，角质层水分含量低下，所以干性肤质的人选择防晒霜的关键是能给皮肤提供水分和营养。干性皮肤的人需要选择质地滋润，除了防晒还带有补水功效的防晒霜。
（3）敏感皮肤：敏感肤质的人皮肤天生防御能力低，皮肤角质层较薄，更易被晒伤。所以敏感肤质的'人选择防晒霜时一定要格外注意，选择专门针对敏感性肤质的人的防晒霜或者选择一些产品上有注明“不含防腐剂”、“通过过敏性测试”。
1、防晒霜能直接涂脸上吗
不可以。防晒霜对肌肤是有伤害的，防晒指数越高，伤害就越大。因此，涂防晒霜前要先做好基础的打底，形成隔离。否则很容易堵塞毛孔，阻碍皮肤的正常代谢，引发色斑、粉刺等皮肤问题。
2、涂防晒霜之前要涂什么
第一步：爽肤水
爽肤水的作用是再次清洁，以恢复肌肤表面的酸碱值，并调理角质层，使肌肤更好地吸收，并为使用保养品作准备。
第二步：保湿乳液
乳液含水量很高，可以瞬间滋润肌肤，其中所含的油脂，又可以隔离外界干燥的气候，防止肌肤水分过快流失，避免肌肤干裂，起皮。
第三步：面霜
涂完乳液后，要再上一点轻质的面霜加强锁水保湿的作用，同时又能形成隔离，防止防晒霜的成分堵住毛孔。
第四步：隔离霜
如果是需要化妆或者长时间面对电脑，可以选择合适的隔离霜，让皮肤与外界的辐射、脏空气、化妆品形成隔离。
第五步：防晒霜
做好前面四个步骤后，最后就是涂防晒霜。所用的防晒霜看SPF值、PA值，最好与要活动的场合相符，如果是海边、军训等，紫外线强度较高的场合，选择SPF30以上防晒才会有效，如果是日常上班，SPF15足够了。
3、涂防晒霜后要注意什么
室外2-3小时补一次
防晒霜并不是涂了就能一直有效果的，特别是在室外，每隔2-3小时要补涂一次，室内的话，可以半天补一次。
彻底卸妆
防晒霜属于化妆品，含有很多化学成分，涂在脸上不卸妆的话，会堵塞毛孔，影响皮肤的呼吸作用，最终会导致毛孔堵塞、长色斑、粉刺等一系列皮肤问题。
大宝防晒霜可以涂脸吗
一般来说大宝防晒是可以涂在脸上的，不过也要注意如果出现过敏情况就不要再使用了，并且防晒霜一般在出门半小时前使用效果最好，但是大宝防晒霜的防晒系数比较低。
大宝清爽保湿防晒露，蕴含水 矿油 甘油 鲸蜡硬脂醇 聚二甲基硅氧烷(硅油) 月桂醇磷酸酯钾 超氧歧化酶(SOD) 人参根提取物 膜荚黄芪根提取物 甘油硬脂酸酯 EDTA二钠 香精 羟苯甲酯 羟苯丙酯 DMDM乙内酰脲。
大宝清爽保湿防晒露75gSPF 20/PA++，有效防晒。同时抵御紫外线UVA和UVB， 减少肌肤晒伤、晒黑。清爽透气不油腻，质地轻薄,清爽透气无负担, 为肌肤提供舒适的夏日防护。
产品质地温和，适合与家人分享。因为大宝清爽保湿防晒露不能防水防油的特性，清爽保湿防晒露并不需要使用专业的卸妆产品卸除，只需要用普通的深层洁面型的洗面奶，就可以轻松卸除了。
大宝防晒霜好吗
好像大宝最近新出的产品在外包装方面走小清新路线，反面有详细的说明，它是75g的，也可以用很久啦。纸盒的头部有封贴，可以保证是否有人用过或拆开过，让人很放心。打开纸盒后，可以发现它是简洁的白色外包装，整体感觉还不错。
两个++足够日常的防护了。有标明限期使用日期，螺旋式的盖子，瓶口很小，可以很好地控制使用的量，不怕浪费。使用效果展示：挤出来是白色的乳液般的质地，淡淡的清香，很好闻。延展性很好，一抹就开了，十分轻薄，很快就吸收了。
涂抹了防晒露的那一部分比较光滑，细致。而没有涂抹的那一部分比较粗糙，手部的纹路也比较明显。大宝防晒霜湿度报告，这是使用前的，肌肤处于比较干燥缺水的状态，只有26%左右。
大宝防晒霜价格介绍
价格：39.9元
产品名称：大宝 清爽保湿防晒露SPF20/PA++
化妆品保质期: 36个月
防晒指数: SPF20
PA值: PA++
适用对象: 通用
规格类型: 正常规格
化妆品净含量: 150g
适用部位: 全身防晒
分类: 防晒乳/霜
品牌: 大宝
面部防晒单品: 清爽保湿防晒露SPF20/PA++
适合肤质: 任何肤质
是否为特殊用途化妆品: 是
功效: 防晒
大宝防晒霜孕妇能用吗
不建议孕妇使用。
建议孕妇选择一些专门针对孕期女性所开发的性质温和的产品，尽量不使用美白类产品，尽量以保湿的防护类为主，不要适用多功能护肤产品。大宝防晒霜具有保湿防晒双重功效，轻薄透气不粘腻 主要成分： SPF20/PA++——有效防护UVAUVB SPF20减少肌肤晒红、晒伤。 PA++减少肌肤晒黑、防止肌肤老化。
海藻精华——“全方位”保湿能手 增加肌肤的保水性，防晒同时水润肌肤。 多种海洋矿物——来自大海的清爽魔力 质地轻薄，不黏腻，肌肤无负担。使用后的肌肤非常清爽，不会很黏腻;大宝清爽保湿防晒露的质地比水稍微浓稠，涂在肌肤上延展性好，触感光滑水润;对比使用这款防晒露前后区别，发现肤色由暗黄变得白皙嫩滑，说明大宝清爽保湿防晒露可以修正肤色。
B. 生信分析软件总结合集
持续更新中
EDTA ：TE 注释工具。是一个可以从头注释全基因组中的TE并且评估已有TE库注释优劣的工具包。该工具的主要步骤是过滤掉原始TE中注释错误的，从而注释出全基因组中较高质量的非冗余TE库。
OrthoFinder ：做进化、基因家族分析、比较基因组使用。它查找直系群和直系同源物，推断所有直系群的根源基因树，并识别这些基因树中的所有基因重复事件。 它还为要分析的物种推断出一个有根的物种树，并将基因复制事件从基因树映射到物种树中的分支。
TRF ：是基因组注释中常用于检测序列中串联重复序列的软件。
cafe ：基因家族收缩和扩张。
GMATA ：分析基因组中的SSR序列（SSR：微卫星序列，串联重复）
RepeatMasker ：鉴别转座子（TE）屏蔽转座子（TE）。
PASA ：是一种真核生物基因组注释工具，利用转录组数据的可变剪接比对自动构建的基因结构模型，从而保持基因结构注释与转录组实验数据一致。（基于转录组测序）
GeMoMa ：是基于同源性进行基因预测的软件。通过近缘物种蛋白编码基因对本物种的序列进行基因结构的预测，主要是根据氨基酸和内含子的保守性。此外，也可以整合转录组比对数据进行可变剪接位点的分析。
AUGUSTUS ：是真核基因组结构从头预测软件，主要运用广义隐马尔可夫的概率模型(GHMM)进行基因结构的预测。通过分析DNA序列在概率模型中最有可能的基因结构，从而发现目标DNA序列中的基因。此外软件自身包含常见模式生物训练集，可利用这些物种直接进行基因预测；也可以利用同源预测和转录组最优结果生成训练集，预测基因。
EVM ：对收集到的这些数据进行整合，获得非冗余外显子集合，从而定义出更加可靠的基因结构。（整合基因结构）
fastp ：最新的质控软件。
Hisat2 ：质控之后的比对软件。
Stringtie ：将比对信息转为转录本坐标文件。
MUSCLE ：蛋白质水平多序列比对软件，和ClustalW、T-coffee相比速度最快。
hasit2、STRA ：基因组比对软件，STRA更准确，但计算速度慢，所需内存大。
bowtie2 ：转录组比对软件。
C. 电脑恢复出厂设置就没有开机密码了吧
没有了，都需要等完全恢复到初始之后重新设置。所以有什么文件也建议备份好，避免因为恢复而使数据遗失。
D. 2022-05-27软件安装：EDTA的安装与配置
参考
https://www.jianshu.com/p/10e3e9715a77 （使用conda一键安装；这里可能需要更新一下RepeatMasker自身带的库文件，详细见先前）
https://www.jianshu.com/p/ddd1c9a74fde （详细介绍了四种安装方法和使用方法）
E. 2020-08-24质粒构建
获取一个基因CDS序列的方法如下：
打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）
然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!
正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。
点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。
最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。
这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如下引物：
好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终于到正题了！
待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。
首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：
模板的获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事项及原理
注意事项：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。
如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。
操作步骤
步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
ABOUT 质粒抽提
实验原理：
较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。
注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。
注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。
注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
9、重复操作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤
11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。
可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。
一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：
2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:
F. ISO-TBE是什么意思
ISO是一种光盘镜像文件，无法直接使用，需要利用一些工具进行解压后才能使用；TBE是一个网友自发组成的黑客组织，是他们破解了matlab。可把“-TBE删掉”，留下ISO就可以用虚拟光驱打开或者直接解压了。
TBE（Tris硼酸），是一种PCR技术中用到的缓冲液。54gTris碱 27.5g硼酸 20ml/L EDTA 采用无菌水溶解混匀，NaOH调pH至8.0，溶液体积1L。TBE配方：使用液（0.5×）；0.025mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA 采用无菌水溶解混匀，溶液体积为1L；浓贮存液（5×）。